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實時熒光定量PCR常見問題及注意事項

釋出時間☁│: 2020-12-29   

常見問題分析

1. 做標準曲線時候·✘,可否用2個不同體系濃度的稀釋分別對於內參和目的基因•◕▩│?

建議最好用同樣稀釋倍數做曲線·✘,因為模板濃度會影響擴增效率✘✘✘·。

2. 熔解曲線中·✘,Tm不出現在80度左右•◕▩│?

擴增片段100bp左右的·✘,一般應該出現在80度左右✘✘✘·。如果低於此溫度出現·✘,可能是模板降解✘✘✘·。

3. 擴增曲線沒有Ct值·✘,僅僅一條斜線•◕▩│?什麼原因•◕▩│?

模板濃度過低或者模板降解✘✘✘·。

4. 如果內參和目標基因表達量差別比較大·✘,也就是目的基因的表達量少·✘,

Ctcon=15·✘,Cttarget=38·✘,可否應用•◕▩│?

可以用於資料分析✘✘✘·。因為表達量低·✘,從而用過高模板進行擴增·✘,從而同內標的模板不同·✘,反而會增大資料統計的誤差✘✘✘·。

5. 引物濃度可否是50nM·✘,是否太低•◕▩│?

如果擴增曲線和熔解曲線比較好·✘,這個濃度當然可以✘✘✘·。如果更低·✘,擴增結果好的情況下·✘,同樣可以運用✘✘✘·。

一句話·✘,所有的模板₪╃、引物等濃度儘量不要用高的·✘,會影響擴增效率✘✘✘·。

6. miRNA多個擴增時候·✘,如果一個的擴增效果比較·✘,其它熔解曲線不止一個峰·✘,如何解決•◕▩│?

Primer對於miRNA是專一的✘✘✘·。所以重新設計引物是不可取的✘✘✘·。那麼只能是提高Tm或者更換mastermix等✘✘✘·。反應體系會影響反應產物的✘✘✘·。

7. 相對定量方法·✘,如果用Ct值比較·✘,是各個樣品平均後在2delt Ct還是分別2 delt Ct在平均比較好•◕▩│?

相對定量的方法各有優缺點·✘,主要取決於實驗的目的和材料的準備✘✘✘·。如果是材料群體個體差異不大·✘,這2種方法基本沒有很大的區別;如果是個體差異比較大·✘,建議用雙標準曲線做✘✘✘·。就是分別做內參和目的基因的標準曲線·✘,分別帶入Ct值計算✘✘✘·。

8. 熔解程式可否不加•◕▩│?

如果是擴增效果好·✘,特異擴增·✘,可以不加熔解程式;但建議做好加上✘✘✘·。

9. 擴增反應體系5uL·✘,擴增效率低·✘,什麼原因•◕▩│?

反應體系小·✘,各種因素的影響比較大·✘,比如引物濃度₪╃、模板濃度及其金屬離子等會影響擴增效率的✘✘✘·。

10. 如何減少非特異性擴增的干擾•◕▩│?

設計一對好引物·✘,提高primer的退火溫度·✘,以及設定吸光溫度✘✘✘·。



其他注意事項☁│:   按照正確的開關機順序操作·✘,有助於延長儀器的使用壽命·✘,減少儀器出故障的頻率✘✘✘·。開機順序☁│:先開電腦·✘,待電腦完全啟動後再開啟定量PCR儀主機·✘,等主機面板上的綠燈亮後即可開啟定量PCR的收集軟體·✘,進行實驗✘✘✘·。關機順序☁│:確認實驗已經結束後·✘,首先關閉訊號收集軟體·✘,然後關掉定量PCR儀主機的電源·✘,最後關閉電腦✘✘✘·。 2.        應該定期備份您的實驗資料·✘,備份頻率推薦每週一次·✘,用光碟燒錄✘✘✘·。同時您也應該備份定量PCR儀的各種純熒光光譜校正檔案₪╃、背景檔案和安裝驗證實驗資料·✘, 3.        良好的實驗室環境有助於延長儀器的使用壽命·✘,減少儀器出故障的頻率✘✘✘·。推薦做到以下幾個方面☁│: 電源☁│:推薦配備合適的UPS或穩壓器✘✘✘·。 通風☁│:儀器的通風應該沒有阻擋✘✘✘·。 溫度☁│:推薦實驗室配備空調·✘,溫度應該控制在10-30°C之間✘✘✘·。 溼度☁│:20-80%;對於潮溼的省份·✘,推薦實驗室配備除溼機✘✘✘·。 空間☁│:易於操作·✘,安全✘✘✘·。 4. 怎樣判斷定量PCR儀的樣本加熱塊是否被汙染•◕▩│?怎樣清除汙染     一個辦法是執行背景校正反應板·✘,當一個或多個反應孔連續顯示出不正常的高訊號·✘,則表明該孔可能被熒光汙染物✘✘✘·。另外一種辦法是在不放任何物品到樣本塊上的前提下·✘,執行ROI的校正·✘,當某個孔的訊號明顯高出其他孔時·✘,則表明該孔被汙染✘✘✘·。     清除樣本加熱塊汙染的步驟如下☁│:用移液器吸取少量乙醇並滴入每個汙染的反應孔中✘✘✘·。 吹打數次✘✘✘·。 將廢液吸入廢液杯中✘✘✘·。重複以上步驟☁│:乙醇三次·✘,去離子水三次✘✘✘·。確認反應孔中的殘留液體蒸發完✘✘✘·。


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