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細胞表面抗原染色

釋出時間▩·₪•◕: 2020-09-22   

細胞表面分子流式檢測步驟說明注意事項

1. 在使用抗體之前✘•✘,快速甩動一下✘•✘,使之聚集到管的底部;

2. 熒游標記的抗體應該避光儲存在4℃✘•✘,不要冷凍;

3. 當染色的時候✘•✘,固定或延遲分析可能降低某些抗體的熒光訊號•·◕✘•。為了得到更好的結果✘•✘,染色後應該馬上分析•·◕✘•。

過程概述▩·₪•◕:

1. 製作外周血✘✘│、淋巴組織或者培養細胞的單細胞懸液;

2. 細胞染色抗體(包括直接標記抗體和間接標記抗體);

3. 洗滌步驟棄掉所有的為束縛的試劑

4. 執行分析流式儀•·◕✘•。

注意▩·₪•◕:流式細胞染色實驗中✘•✘,所有實驗條件的最佳化都很重要•·◕✘•。關鍵引數包括靶細胞✘✘│、抗體效價以及動力學•·◕✘•。

試驗A▩·₪•◕:小鼠淋巴細胞懸液的免疫熒光染色

材料▩·₪•◕:12×75 mm的圓底試管(Falcon Cat.No.2008)或96孔圓底微量滴定板(Falcon Cat.No.3910)✘•✘,原始抗體(既未純化也未偶聯)✘•✘,

緩衝液▩·₪•◕: eBioscience流式染色緩衝液(Cat.No.00-4222)✘•✘,流式鞘液

儀器▩·₪•◕:移液管和移液器✘•✘,離心機✘•✘,冰櫃或冰箱✘•✘,流式儀

試驗時間

半個小時細胞準備✘•✘,半個小時抗體稀釋和樣品準備✘•✘,半個小時到一個小時孵育過程✘•✘,半個小時以上的執行和分析時間

方法細胞準備▩·₪•◕:

1. 採集組織(脾✘•✘,淋巴結✘•✘,胸腺)✘•✘,用注射器的活塞擠壓以製成單細胞懸液✘•✘,此過程用10ml的染色緩衝液;

2. 轉移到50ml的圓錐形試管中並使大塊沉澱到試管底部或者透過尼龍濾網過濾✘•✘,得到單細胞懸液;

3. 4℃ 離心沉澱細胞懸液4-5分鐘(300-400g)✘•✘,棄掉上清;

4. 如果上過程採集的脾✘•✘,還用用RBC裂解✘•✘,否則進入下一步;

5. 用50ml染色液重懸樣本✘•✘,進行細胞計數和活力分析;

6. 再次離心細胞✘•✘,棄掉上清✘•✘,重懸細胞使其細胞數達到2×107 個/ml;


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